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引言

本系列开启R中单细胞RNA-seq数据分析教程^[1]，持续更新，欢迎关注，转发！

10. 伪时间细胞排序

如前所述，在 UMAP 嵌入中看到的背侧端脑细胞形成的类似轨迹的结构，很可能代表了背侧端脑兴奋性神经元的分化和成熟过程。这个过程很可能是连续的，因此将其视为一个连续的轨迹，而非不同的聚类，更为合适。在这种情况下，进行所谓的伪时间细胞排序或伪时间分析会更加具有信息价值。

目前，有许多不同的伪时间分析方法。常见的包括扩散图（在 R 的 destiny 包中实现）和 monocle。在这里，将展示如何使用 destiny 对数据中的背侧端脑细胞进行伪时间分析。

首先，提取感兴趣的细胞。接下来，会重新识别这些细胞的高变基因，因为在这些细胞之间，代表背侧端脑细胞与其他细胞的差异的基因不再是有用的。

seurat_dorsal <- subset(seurat, subset = RNA_snn_res.1 %in% c(0,2,5,6,10))
seurat_dorsal <- FindVariableFeatures(seurat_dorsal, nfeatures = 2000)

正如你可能已经注意到的，背侧端脑神经前体细胞（NPC）中有两个聚类与第三个聚类分开，原因是它们处于不同的细胞周期阶段。由于关注的是分化和成熟过程中的整体分子变化，细胞周期的变化可能会对分析产生较大的干扰。因此，可以尝试通过排除与细胞周期相关的基因，来减少细胞周期对分析结果的影响。

VariableFeatures(seurat) <- setdiff(VariableFeatures(seurat), unlist(cc.genes))

接下来，可以创建一个新的 UMAP 嵌入，并绘制一些特征图来检查数据的表现。

seurat_dorsal <- RunPCA(seurat_dorsal) %>% RunUMAP(dims = 1:20)
FeaturePlot(seurat_dorsal, c("MKI67","GLI3","EOMES","NEUROD6"), ncol = 4)

结果不是很理想。G2M 细胞不再集中在单独的聚类中，但它仍然干扰了细胞类型分化的轨迹。例如，EOMES+ 细胞被分布在两个不同的群体中。需要进一步减少细胞周期的影响。

如上所述，ScaleData 函数提供了一个选项，可以将表示不必要变异来源的变量纳入其中。可以尝试利用这个选项，进一步减少细胞周期的影响；不过在这之前，需要为每个细胞生成细胞周期相关的评分，以描述它们的细胞周期状态。

seurat_dorsal <- CellCycleScoring(seurat_dorsal,
                                  s.features = cc.genes$s.genes,
                                  g2m.features = cc.genes$g2m.genes,
                                  set.ident = TRUE)
seurat_dorsal <- ScaleData(seurat_dorsal, vars.to.regress = c("S.Score", "G2M.Score"))

接下来，可以创建一个新的 UMAP 嵌入，并绘制一些特征图来检查数据的表现。

seurat_dorsal <- RunPCA(seurat_dorsal) %>% RunUMAP(dims = 1:20)
FeaturePlot(seurat_dorsal, c("MKI67","GLI3","EOMES","NEUROD6"), ncol = 4)

虽然结果不是完全理想，但至少不再看到两个分开的 EOMES+ 细胞群体。

接下来，让尝试运行扩散图，以便对细胞进行排序。

library(destiny)
dm <- DiffusionMap(Embeddings(seurat_dorsal, "pca")[,1:20])
dpt <- DPT(dm)
seurat_dorsal$dpt <- rank(dpt$dpt)
FeaturePlot(seurat_dorsal, c("dpt","GLI3","EOMES","NEUROD6"), ncol=4)

为了展示沿着构建的伪时间的表达变化，带有拟合曲线的散点图通常是一种直观的方法。

if (is(seurat_dorsal[['RNA']], 'Assay5')){
    expr <- LayerData(seurat_dorsal, assay = "RNA", layer = "data")
} else{
    expr <- seurat_dorsal[['RNA']]@data
}

library(ggplot2)
plot1 <- qplot(seurat_dorsal$dpt, as.numeric(expr["GLI3",]),
               xlab="Dpt", ylab="Expression", main="GLI3") +
         geom_smooth(se = FALSE, method = "loess") + theme_bw()
plot2 <- qplot(seurat_dorsal$dpt, as.numeric(expr["EOMES",]),
               xlab="Dpt", ylab="Expression", main="EOMES") +
         geom_smooth(se = FALSE, method = "loess") + theme_bw()
plot3 <- qplot(seurat_dorsal$dpt, as.numeric(expr["NEUROD6",]),
               xlab="Dpt", ylab="Expression", main="NEUROD6") +
         geom_smooth(se = FALSE, method = "loess") + theme_bw()
plot1 + plot2 + plot3

11. 结果保存

这就是本教程第一部分的全部内容，涵盖了对单个 scRNA-seq 数据集进行的大部分基础分析。在分析结束时，当然希望保存结果，可能是操作过一段时间的 Seurat 对象，这样下次就不需要重新运行所有分析了。保存 Seurat 对象的方法与保存其他 R 对象一样。可以使用 saveRDS/readRDS 来分别保存和加载 Seurat 对象。

saveRDS(seurat, file="DS1/seurat_obj_all.rds")
saveRDS(seurat_dorsal, file="DS1/seurat_obj_dorsal.rds")

seurat <- readRDS("DS1/seurat_obj_all.rds")
seurat_dorsal <- readRDS("DS1/seurat_obj_dorsal.rds")

或者可以使用 save/load 来一起保存或加载多个对象。

save(seurat, seurat_dorsal, file="DS1/seurat_objs.rdata")
load("DS1/seurat_objs.rdata")

未完待续，欢迎关注！

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