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2021年12月21日，美国阿肯色大学、德克萨斯大学和肯塔基大学的研究人员合作在《Aging Cell》杂志发表了题为“Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging”的Short Take研究论文，该研究通过使用简化甲基化测序（RRBS）、核糖体DNA（rDNA）和线粒体特异性甲基化分析、高分辨率靶向甲基化分析和DNAge™ 表观遗传衰老时钟分析对小鼠自愿耐力/阻力运动训练（渐进式负重轮跑，PoWeR）的可翻译模型，揭示运动可以延缓骨骼肌的表观遗传衰老。

标题：Late-life exercise mitigates skeletal muscle epigenetic aging晚年锻炼延缓骨骼肌表观遗传衰老

时间：2021.12.21

期刊：Aging Cell

影响因子：IF 11.005

技术平台：RRBS等

样本实验：

研究摘要：

包括骨骼肌在内的所有组织在整个生命周期中都会发生DNA甲基化变化，且结构和功能可能随着年龄增长而下降。运动训练会改变肌肉DNA甲基化，但是否会导致老年小鼠骨骼肌甲基化更接近年轻小鼠的甲基化尚不清楚。本研究对22-24月龄小鼠进行渐进式负重轮跑（PoWeR）的高容量阻力/耐力训练，训练结束后，通过RRBS甲基化测序分析、核糖体DNA（rDNA）和线粒体特异性甲基化分析、高分辨率靶向甲基化分析和＞500个组织特异性小鼠CpG位点的高覆盖率表观遗传衰老时钟分析（DNAge™分析），评估运动对骨骼肌表观遗传衰老的作用，并将结果与Horvath泛组织表观遗传衰老时钟进行重叠分析。结果表明22-24月龄的晚年小鼠PoWeR显著减缓了与年龄相关的启动子甲基化变化。PoWeR训练8周后的老年小鼠（aged PoWeR）肌肉表观遗传年龄大约比24月龄的久坐小鼠（aged sedentary）年轻8周，约占预期小鼠寿命的8%。这些数据为运动减缓骨骼肌衰老提供了分子基础。

研究结果

（1）骨骼肌的RRBS分析

与4月龄年轻小鼠相比，久坐的24月龄小鼠腓肠肌的启动子区域（即转录起始位点上游1 kb内）的103个特异性CpG位点低甲基化（FDR＜0.05），而比对到133个不同基因中至少一个基因对应的762个不同CpG位点高甲基化（FDR<0.05，图1a）。对老年肌肉高甲基化启动子基因的通路分析表明，三羧酸循环（TCA）调节（p=0.00572，q=0.125）中的过表达，特别是与NAD活性相关的基因（图1b）。在外显子区域比对到27个基因中至少一个基因对应的68个CpG位点表现出低甲基化，而比对到146个基因中至少一个基因对应的864个不同CpG位点在老年久坐小鼠肌肉中高甲基化（FDR<0.05，且老年久坐小鼠的内含子甲基化模式相同；比对到131个基因中至少一个基因对应的271个CpG位点低甲基化；而比对到301个基因中的至少一个基因对应的2261个CpG位点高甲基化（FDR<0.05）。随着年龄的增长，所有三个区域中（启动子、外显子、内含子）没有基因随着年龄而低甲基化，而所有三个区域中有18个基因高甲基化。

图1：年轻、老年久坐和老年渐进式负重轮跑（PoWeR）小鼠肌肉中启动子甲基化变化。

（a） 老年久坐小鼠与年轻小鼠腓肠肌中启动子CpG甲基化百分比（距转录起始位点≤1 kb）（所有位点*FDR<0.05；相同CpG的老年PoWeR甲基化显示为参考）。

（b） 与年轻小鼠相比，三羧酸（TCA）循环基因启动子随年龄增长而高甲基化，插图显示启动子CpG平均甲基化。

（c） 与年轻小鼠相比，老年久坐小鼠肌肉中的基因启动子区域的低甲基化，但老年PoWeR小鼠中的基因未低甲基化。

（d） 与年轻小鼠相比，老年久坐小鼠肌肉中的基因启动子区域的高甲基化，老年PoWeR小鼠中的基因未高甲基化。

（e） Rbm10和Timm8a1启动子区甲基化；x轴表示基因启动子区中单个CpG位点的染色体位置。使用所有组的广义线性模型来确定差异甲基化，通过使用Benjamini–Hochberg方法控制错误发现率（FDR）来校正多重比较（α=0.05）

（2）核糖体DNA（rDNA）甲基化和DNAge™分析

rDNA随着年龄的增长而高甲基化，并具有高度保守的衰老甲基化时钟。本研究在rDNA中鉴定出360个CpG位点，这些位点在老年小鼠和年轻小鼠肌肉中差异甲基化（FDR<0.05），其中15个位点低甲基化，345个位点高甲基化。在PoWeR训练后，久坐小鼠中有9个位点低甲基化（图2a）。PoWeR训练将老年小鼠与年轻小鼠肌肉中11个位点的甲基化水平向年轻小鼠转移（图2b）。对增强子区域位点（CpG 43519）及其周围的甲基化水平使用靶向高分辨率甲基化分析（平均每个rDNA CpG的覆盖率>10000倍），结果表明与单独衰老相比，运动导致的更多甲基化水平，这些位点在年轻小鼠中无论运动与否均呈现高甲基化水平。从RRBS分析可以得出结论，运动可以改变老年肌肉中的rDNA甲基化，但靶基因分析揭示了reads覆盖度对绝对甲基化水平的潜在影响（位点43519的RRBS覆盖度平均为23倍）。

图2：核糖体DNA（rDNA）甲基化和DNAge™ 分析。

（a） 与年轻小鼠相比，rDNA CpG（按染色体位置列出）在老年久坐小鼠肌肉中低甲基化（*FDR<0.05），但在老年PoWeR小鼠肌肉中未低甲基化。

（b） 与年轻小鼠相比，rDNA CpG（按染色体位置列出）在老年久坐小鼠肌肉中高甲基化（*FDR<0.05），但在老年PoWeR小鼠肌肉中未高甲基化。

（c） 老年久坐小鼠与老年PoWeR小鼠肌肉的DNAge™分析，使用定向t检验分析。使用所有组的广义线性模型来确定（a）和（b）中的差异甲基化，并通过使用Benjamini-Hochberg方法控制错误发现率（FDR）来校正多重比较（α=0.05）；直方图用直线表示中位数。

PoWeR训练8周后的DNAge™分析对研究小鼠腓肠肌中年轻的表观遗传年龄足够敏感，最近的进展有望提高肌肉特异性甲基化的衰老时钟的稳健性和准确性。未来的研究可能会阐明哪些运动对DNAge的影响与衰老无关。在某些情况下，与其他相关因素（如体重或心肺功能）相比，年龄与肌肉功能障碍的相关性较小。不过运动对减缓肌肉表观遗传衰老的研究结果支持了最近对人类的针对性观察，且越来越多的证据表明运动是延长健康寿命的一种策略。一旦肌肉纤维中动态DNA甲基化变化机制基础得到更明确的定义，随着年龄增长，改善肌肉健康将成为潜在可修饰的表观遗传标记。

关于易基因简化基因组甲基化测序（RRBS）研究解决方案

简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利用限制性内切酶对基因组进行酶切，富集启动子及CpG岛等重要的表观调控区域并进行重亚硫酸盐测序。该技术显著提高了高CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率，是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用前景。

为适应科研技术的需要，易基因进一步开发了可在更大区域内捕获CpG位点的双酶切RRBS(dRRBS)，可研究更广泛区域的甲基化，包括CGI shore等区域。

为助力适用低起始量DNA样本（5ng）量多维度甲基化分析，易基因开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的甲基化靶向基因组测序方法：extended-representation bisulfite sequencing（XRBS），实现了高灵敏度和微量样本复用检测，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞基因组CG位点覆盖高达15M以上。

技术优势：

起始量：100ng gDNA；

单碱基分辨率；

多样本的覆盖区域重复性可达到85%-95%、测序区域针对高CpG调控区域，数据利用率更高；

针对性强，成本较低；

基因组CG位点覆盖高达10-15M，显著优于850K芯片。

应用方向：

RRBS/dRRBS/XRBS广泛应用于动物，要求全基因组扫描（覆盖关键调控位点）的：

队列研究、疾病分子分型、临床样本的甲基化 Biomarker 筛选

复杂疾病及肿瘤发病机制等甲基化研究

模式动物发育和疾病甲基化研究

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参考文献：

Klughammer J, et al. Comparative analysis of genome-scale, base-resolution DNA methylation profiles across 580 animal species. Nat Commun. 2023 Jan 16;14(1):232.

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