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大家好，我们来了解这篇《Hydrogel-in-hydrogel live bioprinting for guidance and control of organoids and organotypic cultures》发表在《Nature Communications》的一篇文章。三维水凝胶基器官样培养，如类器官和体外器官型培养，能够自我组织并重现特定组织的结构和一些功能，为研究器官发育、再生和疾病提供了生理相关的体外模型。然而，目前控制工程水凝胶的组成、机械性能和几何约束的方法往往仅限于制造的初始时间，难以根据培养演化实时调制水凝胶的特性。

*本文只做阅读笔记分享*

一、水凝胶-水凝胶活体生物打印技术

为了克服这些限制，研究人员开发了一种水凝胶-水凝胶活体生物打印方法，能够在预先存在的水凝胶基器官样培养物中动态制造指导性水凝胶元素。具体来说，就是在特定的细胞培养时间点，将光敏液体聚合物加载到预存的凝胶化Matrigel中，光敏聚合物会在Matrigel中自由扩散，随后通过飞秒近红外紧聚焦脉冲激光照射使其交联为3D水凝胶结构。

例如，通过荧光漂白恢复（FRAP）实验，发现不同分子量的荧光素异硫氰酸酯 - 葡聚糖（FITC - dextrans）在固体Matrigel中可根据菲克定律自由扩散，扩散系数与在水中的量级相同。并且，扩散后的可溶性光敏聚合物HCC - Gelatin可成功交联为固体结构，在Matrigel中保持2天的结构完整性，不发生肿胀，杨氏模量也保持稳定。

二、在器官型脊髓培养中的应用

为了验证该技术在复杂3D细胞培养系统中的通用性，研究人员在体外器官型脊髓培养中进行了实验。脊髓切片来自胎儿大鼠，嵌入Matrigel液滴中培养2天，当神经轴突开始从器官型切片的中央体萌发时，进行活体生物打印制造HCC - Gelatin水凝胶。

实验结果表明，水凝胶的打印不受神经投射和中央体的干扰，可在中央体上方正确制造。多个水凝胶结构可在不同Z平面打印，嵌入细胞投射且不影响细胞活力和完整性。当HCC - Gelatin水凝胶垂直于器官型切片的中央体时，可引导神经轴突的方向，使其呈现出有模式的组织排列。

三、在癌症类器官研究中的应用

该技术还被用于研究癌细胞在3D环境中的迁移行为。培养A549肺癌腺癌细胞来源的类器官，在培养1天后，制造一系列间距为10 µm的3D CMMC - PEG pillars来限制类器官。结果发现，癌症类器官在生长过程中会接触并变形HCC - PEG pillars，最终癌细胞能够克服柱子带来的几何约束进行迁移。

进一步研究水凝胶机械性能对癌细胞迁移的影响，使用具有不同机械性能的CMM - 4arm或CMM - 8arm PEG聚合物打印柱子，发现CMM - 4arm PEG水凝胶的刚度显著低于CMM - 8arm PEG水凝胶，从更易变形的柱子（4 - arm PEG）中迁移出的细胞核数量在打印7天后显著更高。

此外，通过先制造间距为40 µm的柱子，当类器官接触柱子后，再制造间距为15 µm的柱子形成笼子的实验，观察到类器官在接触第一排柱子后会改变形状，拥抱柱子；当接触到第二排更紧密的柱子时，会发生迁移事件。

四、在小肠类器官形态发生中的应用

利用LGR5 - EGFP - DTR小鼠小肠类器官（mSIOs），研究人员设计了复杂的超类器官3D结构来模拟原始小肠发育。

实验表明，HCC - Gelatin和非粘附性HCC - 水凝胶（PEG基）可限制生长中的囊性mSIOs，诱导其萌芽和LGR5细胞分离。设计的原始小肠结构可引导mSIO萌芽，使其形状适应水凝胶空间。

同时，mSIO在培养过程中细胞活力与未打印对照组相当，细胞身份得以维持，特定干细胞标志物仅在原始肠水凝胶的隐窝状区表达，绒毛分化局限于结构的腔区域。

五、在肝类器官细胞极化中的应用

在人胎儿肝细胞类器官3D培养中，进行活体生物打印生成HCC - Gelatin水凝胶作为远离或邻近正在形成的类器官的墙壁或相邻的支柱结构。

结果显示，在HCC - Gelatin水凝胶存在但无物理约束（如远离墙壁）的情况下，细胞未观察到顶端 - 基底极化；而与HCC - gelatin支柱相互作用的细胞发生极化，MRP2和ZO - 1显著表达朝向类器官内部，β4 - integrin（INTβ4）局限于基底层。

六、在肺原基3D培养中控制肺尖分叉的应用

将小鼠胎儿间充质 - 无肺上皮原基的3D器官型培养与8臂HCC - PEG结构的光打印相结合，在3D肺原基培养24小时后，在芽尖附近打印圆形柱子来控制自发分支的方向。

实验发现，物理交互使胎儿肺尖与柱子驱动芽尖分叉，分叉受柱子引导，且保持了细胞骨架顶端极性，Sox9表达在分叉点下调。

七、总结

水凝胶 - 水凝胶活体生物打印技术为研究器官发育、再生和疾病提供了新的视角和方法。通过在不同的培养体系中应用该技术，研究人员能够调节生物过程，如大小、形状、细胞特性、迁移和形态发生。

然而，该技术也存在一些局限性，如显微镜光学性质的内在限制。未来的研究可以进一步探索该技术在其他领域的应用，以加深对生物发育和疾病机制的理解。

参考文献：

       Urciuolo A, et al. Hydrogel-in-hydrogel live bioprinting for guidance and control of organoids and organotypic cultures. Nat Commun. 2023 May 30;14(1):3128.