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GC/MS分析生物样本为何要衍生化处理？有哪些衍生化的方法？

• GC的流动相为气体（通常为高纯氦），这就要求被分析物必须能够气化，而生物样本中很多内源性代谢物都含有极性基团，具有沸点高、不易气化特点。衍生化能够降低这些代谢物的沸点，增加它们的热稳定性，以便分析能够顺利进行。
• 衍生化方法及试剂种类繁多，根据不同的分析目标，需选择合适的衍生化方法。如分析脂肪酸，我们可以采用甲酯化衍生。在GC/MS代谢平台上，最常用的衍生化方法是硅烷化衍生，因为它的广谱高效。在进行硅烷化衍生之前，还需添加甲氧胺吡啶溶液，以封闭羰基（针对α-酮酸和糖类，保护作用），减少衍生化副产物的生成。

GC/MS能检测到哪些类别的代谢物？

• 衍生化极大地拓展了GC/MS的检测分析范围。GC/MS能检测到有机酸、氨基酸、单糖、糖醇、胺类、脂肪酸、吲哚、单甘油酯、核苷、二糖、生育酚、甾醇和胆汁酸等代谢物。

保留指数是什么？其目的是什么？

• 保留指数（Retention Index）又称科瓦茨（kovats）指数，是重要的定性指标。它需要采用一系列保留指数基准物质（如脂肪酸甲酯和正构烷烃）作为参考，将保留时间转换为指数。
• 相比于保留时间，保留指数的特点是它只和色谱柱类型有关，而和其他仪器参数无关。例如，针对不同的生物样品，我们可能需要不同的升温程序，以达到最佳的色谱分离。此时，代谢物的保留时间就会发生改变，无法和质谱库中的标准时间进行匹配。
• 再比如，色谱柱使用较长时间后，柱前端容易被严重污染，从而影响柱效。我们一般会将柱前端截断30-50公分（更好的方法是色谱柱前添加保护芯片）以恢复柱效。此时，所有代谢物的保留时间都会提前。保留指数不会受到这些实验条件的影响，依然可以用于准确定性。

GC/MS如何提高定性准确度？

• GC/MS的定性有双重标准，一是上文提到的保留指数，二是质谱信息的相似度（similarity）。
• 不同于LC/MS的软电离源，GC/MS使用的EI源属于硬电离，能量较强且稳定，在将代谢物分子电离后，分子离子峰进一步碎裂产生丰富的碎片离子。因此，我们很难在GC/MS上看到分子离子峰。
• GC/MS提供的是代谢物的“指纹图谱”，将仪器得到的实际指纹图谱和质谱库（如NIST库）进行比对后，我们将会得到一个叫相似度的指标。
• 保留指数和相似度都必须满足设定的阈值，软件才会给出色谱峰的定性结果。最后采用标准品质谱信息进行完全比对定性，也就是说只有经过标准品比对，代谢物才是被百分之百定性。

什么是解卷积？

• 总离子流色谱图（TIC）其实是软件根据质谱采集到的一个个数据点拟合出来的。每一个数据点背后就有一张质谱图。
• 当两个或多个色谱峰没有分离开而共流出时，质谱采集到的数据点就是一张混杂的质谱图，包含了多个组分的碎片信息。如果直接用于定性分析会导致物质相似度的降低和组分的丢失。
• 解卷积（Deconvolution）就是利用数学算法将色谱未分离的组分重新解析开，还原它们最真实的质谱信息。需要指出的是，解卷积不是万能的，好的色谱分离依然十分重要。

代谢物的峰面积是如何计算的？

软件会对原始质谱数据做基线计算、平滑、峰查找和解卷积。在解卷积之后，软件会考察代谢物所有碎片的信噪比、碎片提取离子流图（EIC）的对称性以及碎片色谱峰的纯度（共流出干扰的程度），最终自动挑选出一个最优的定量离子（Quant Mass）。最终的峰面积是对定量离子进行积分所得。